GFP : un prix Nobel qui est le fruit de recherches fondamentales ... par hobby !

La GFP : un hobby qui mène parfois au prix Nobel : la recherche fondamentale

Osamu Shimomura Source : Marc Zimmer

Un chercheur de Princeton, Osamu Shimomura (biographie), chargé d'identifier la protéine phosphorescente Aequorine de l'anneau lumineux chez la méduse Aequorea victoria que les courants rassemblent contre la côte est des USA, identifie – un peu par hobby – une autre protéine la Green Fluorescent Protein (GFP) (Shimomura &al. 1962) qui deviendra un outil de localisation des protéines extrêmement utile, et lui vaudra le prix Nobel de Chimie 2008 avec Martin Chalfie et Roger Y. Tsien. Ainsi une recherche mue par la curiosité, dont personne ne voyait l'utilité (c'est en quelque sorte la définition de la recherche fondamentale), a fondé une technique qui fournit des réponses nouvelles dans d'innombrables recherches.

Fig 1 : [img]La méduse Aequorea (Source Nobelprize.org)

Phosphorescence ou fluorescence ?

En fait on confond souvent la phospho-ou fluorescence avec la chimiluminescence qui est la production de lumière à partir d'énergie (chimique sous forme d'ATP par exemple chez les vers luisants, lucioles, dinoflagellés, etc.)
La phosphoresence et la fluoresence sont presque les mêmes phénomemes : une sorte de conversion d'énergie lumineuse d'une couleur vers une autre moins énergétique. la grande différence est que la phosphorescence est durable alors que la fluorescence cesse lorsqu'on éteint la source. Dans le cas de la GFP, excitée par l'UV ou le bleu elle émet dans le vert cf. animation ici.

Fig 2 :La méduse Aequorea produit de la lumière par la phosphorescence de l'Aequorine, bleue, qui est transformée par la fluorescence de la GFP en lumière verte. [img] source : Marc Zimmer

Quand au rôle de cet anneau, beaucoup supposent qu'il attire les proies vers les tentacules garnis de cnidoblastes de la méduse, mais les chercheurs sont - comme toujours – prudents : "Despite interesting speculations, it remains unclear why these coelenterates glow, why green emission should be ecologically so superior to the blue of the primary emitters, and why the animals synthesize a separate GFP rather than mutate the chemiluminescent protein to shift its wavelengths." (Tsien, Y. 1998)

La GFP : fluorescence sous contrôle génétique

Cette protéine a donc d'abord été une curiosité : personne n'en voyait l'utilité et n'aurait alors deviné en quoi cette recherche-là – parmi tant d'autres tout aussi excentriques – deviendrait si importante. Cependant elle est devenue un outil extrêmement important dans d'innombrables labos pour suivre la localisation cellulaire et l'expression des gènes.
En effet elle n'a pas besoin d'un système complexe d'enzymes pour produire de la lumière comme les protéines phosphorescentes (p. ex. le système Luciférine / luciferase des lucioles, vers luisants, etc) : un simple éclairage UV ou bleu la révèle. Elle est non-toxique.
Il suffit d'introduire ce gène (et des séquences régulatrices appropriées) dans un organisme pour produire la protéine et la fluorescence : toute la palette des outils du génie génétique peut être employée pour contrôler quand et où la GFP est produite et le résultat est aisément visible.

• La protéine Aequorin-1: P07164 @ UniProt (séquence, fonction, domaines, etc.)
  
• La protéine Green fluorescent protein, Aequorea victoria (méduse): P42212 @ UniProt (séquence, fonction, domaines, etc.)
• On peut voir en stéréogramme la strucutre de la protéine GFP. (Nécessite une certaine habileté pour accomoder sans converger les 2 yeux...).
  
• On peut la visualiser en 3-d tournable avec Jmol
  

La GFP qui révèle l'expression d'un autre gène

En associant ce gène GFP à un gène qu'on veut étudier (cf fig. 5) , Martin Chalfie a montré qu'on peut révéler où , et quand, la protéine d'intérêt s'exprime dans la cellule.

Fig.4 Visualisation de la tubuline fusionnée à la GFP, dans une cellule de souris. La tubuline est une protéine participant à l’architecture cellulaire. La fluorescence verte montre des fibres de tubuline qui traversent la cellule de part en part. La zone sombre situe le noyau [img]Source : Prolune


Fig 6 :Une construction génique avec le gène de la GFP entre le promoteur et la protéine d'intérêt permet de suivre l'expression du gène d'intérêt. [img] source Nobelprize.org

Un exemple : où agit la protéine HBx du virus de l'hépatite B dans nos cellules ?

Pour explorer l'action d'HBx, une des 4 protéines du virus de l'hépatiteB, le Prof Strubin de l'UniGe a associé cette HBx à la GFP et exploré la multiplication du virus lorsqu'on avait bloqué HBx dans un compartiment cellulaire : Il a trouvé que HBx agit quand elle est dans le noyau. (cf. fig 6).

Fig 7 :La protéine HBx exprimée partout (gauche) ou exprimée dans le noyau seulement (milieu) ou le cytoplasme seulement (droite). La présence de la protéine HBx associée à la GFP se manifeste par une Fluorescence verte. [img] Source : M. Strubin

Ainsi la GFP a permis de vérifier la localisation cellulaire de la protéine HBx et de la corréler avec son activité. Là aussi nous verrons dans un futur Bio-Tremplins comment les tâtonnements de la recherche fondamentale mènent à des publications et font avancer la connaissance (et peut-être un jour prévenir les cancers du foie causés par le virus).

Une palette de couleurs GFP

GFP de différentes couleurs

Roger Y. Tsien, lui, a montré (Tsien RY(1998) que 3 acides aminés au coeur de la protéine (serine ou threonine, tyrosine et glycine, (visualiser en 3-d) produisent un chromophore (c'est là que se produit la fluorescence) et trouvé moyen de modifier la séquence pour produire des GFP de différentes couleurs (Méritant du coup bien moins son nom de Green Fluorescent Protein). On dispose d'un large éventail de protéines fluorescentes de différentes couleurs : cyan (CFP), jaune (YFP), rouge (RFP) (les XFP en général) Shaner &al. (2005)
Ainsi on peut contrôler avec tout l'arsenal du génie génétique la couleur produite en plus du moment et de l'endroit.

Une application récente : colorer les neurones

Une application récente particulièrement spectaculaire, appelée Brainbow en anglais (Livet &al.2007) permet de visualiser les neurones en couleur.
Ils ont utilisé "le système de recombinaison Cre/lox : on obtient l’excision ou l’inversion du segment d’ADN situé entre ces derniers" (Source) qui produit une sorte de tirage au sort des gènes - un peu comparable à ce que fait le système immunitaire pour produire l'énorme variété des anticorps lors de sa maturation.
Ainsi ce système combine 3 gènes et donc 3 fluorescences au hasard et colore chaque neurone d'une couleur différente (cf ici)
Dans le prolongement du travail de Santiago Ramón y Cajal (1852-1934) qui colorait les neurones en noir, cela permet de suivre individuellement les interconnexions de très nombreux neurones à la fois. Une animation très belle permet de voir une tranche de tissus nerveux avec les neurones colorés.


Fig 8 :Une image du cortex cérébral dans la matière dite grise (sic!) [img] (Confocal image by Tamily Weissman. Mouse by Jean Livet and Ryan Draft.)source Marc Zimmer ici

Comprendre : une dimension esthétique accrue ?

Ces images valent mieux que certaines décoration de Noël .... Peut-être faudrait-il transformer la matière grise en matière arc-en-ciel pour le plaisir des yeux dans les classes ?
Dans le fond pourquoi a rigueur scientifique devrait-elle s'opposer à l'esthétique ?
Kant 1790 distingue l"agréable" lié aux besoins fondamentaux et le "beau" et lié à compréhension : ainsi l'expert est capable de ressentir plus de beauté que le néophyte et apprendre la science c'est accéder à plus de beauté.
Aussi la compréhension de ces images renforce encore leur puissance esthétique –déjà considérable – et pourrait peut-être contribuer à dissiper l'image austère des sciences ?

En français ?

• Yann Cornillier (2007) Brainbow, une approche multicolore pour comprendre le développement du système visuel INSERM Actualités
  
• Livet, J., Weissman, T., Kang, H., Draft, R., Lu, J., Bennis, R., et al. (2007) Supplementary information
  
• Livet, Jean. (2007) Brainbow ou le cerveau en couleurs Médecine/Science, Décembre 2007, Volume 23 | n° 12
• Une recherche sur Google images avec le mot-clé "Brainbow" révèle d'innombrables images de cette technique aussi bien dans le monde scientifique que dans l'art ou l'actualité.
  

Plus d'info sur la GFP

• Tout sur la GFP par Marc Zimmer (An)
• Prolune Instantané N° 48 octobre 2008 GFP
• Lire aussi le dossier "A la lueur d’une protéine" et les Protein Spotlight "The greenest of us all" et "Bio-Art" (en anglais).
• Brainbow : Baillie Gerritsen, Vivienne. (2009) paint my thoughts Protein Spotligh August 2009
  

Sources

• Alberts, Bruce. et al. ( 2007) Molecular Biology of the Cell,. Garland Fifth Edition
• Li, T., Robert, E. I., van Breugel, P. C., Strubin, M., & Zheng, N. (2009). A promiscuous [alpha]-helical motif anchors viral hijackers and substrate receptors to the CUL4-DDB1 ubiquitin ligase machinery. Nat Struct Mol Biol, advance online publication.
  
• Liu, Z., Song, J., Wang, Z., Tian, J., Kong, Q., Zheng, Z., et al. (2008). Green fluorescent protein (GFP) transgenic pig produced by somatic cell nuclear transfer. Chinese Science Bulletin, 53(7), 1035-1039.
  
• Livet, J., Weissman, T., Kang, H., Draft, R., Lu, J., Bennis, R., et al. (2007). Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature, 450(7166), 56-62. doi:10.1038/nature06293;
• Salzberg, S. L., White, O., Peterson, J., & Eisen, J. A. (2001). Microbial Genes in the Human Genome: Lateral Transfer or Gene Loss? Science, 292(5523), 1903-1906.
• Shaner NC, Steinbach PA, Tsien RY.(2005) A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods 2005 ; 2 : 905-9.
• Shimomura O, Johnson FH, Saiga Y. 1962 Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea.. J. Cell. Comp. Physiol. 59:223–39 [Medline]
• Tsien RY(1998).The green fluorescent protein.Annu Rev Biochem. 1998;67:509-44. (review : intranet.pdf)

Update le 17 I 010 rectification de la phospho et fluorescence : merci Karim Kahtib