mercredi 10 octobre 2007

le Nobel des Souris K.O.

Le prix Nobel de Physiologie et médecine a été attribué pour 2007 à Mario Capecchi de l'Université d'Utah à Salt Lake City, Oliver Smithies de l'Université de North Carolina, Chapel Hill, et Martin Evans de l'Université de Cardiff, U.K. Ils ont développé dans les années 1980 les techniques permettant de produire des souris Knockout auxquelles un gène spécifique manque. Cette technique est très largement utilisée, pour comprendre le rôle de ces gènes, fournir un modèle biologique de certaines maladies pour tester les thérapies potentielles.

Comment produire une souris Knockout ?
Au coeur de cette méthode on a la recombinaison homologue : le fait que si on insère un ADN très similaire à celui d'un gène, la cellule peut l'insérer à la place de l'original. Si l'ADN introduit est modifié de manière à rendre le gène inactif, on peut changer spécifiquement des gènes à volonté.

Dans son principe cet ensemble de techniques est assez simple :

Introduire le gène

Le gène à insérer est isolé, on l'encadre de séquences homologues au gène a supprimer, on y associe un gène "marqueur" de résistance à un antibiotique, dans un plasmide bactérien.

Par électroporation, on l'introduit alors dans une cellule où il peut par recombinaison homologue, parfois, remplacer le gène d'origine. On sélectionne alors les cellules où cela s'est effectivement produit à l'aide d'un antibiotique qui élimine toutes les cellules qui n'ont pas incorporé la construction génique nouvelle.

Ces opération se font souvent avec des cellules souches embryonnaires, à cause de leur totipotence.

Produire un organisme où ce gène est exprimé

Elles sont introduites dans un blastocyste (très jeune embryon) où elles sont intégrées à l'organisme en formation. L'embryon est implanté dans une souris porteuse. Il en résulte des organismes mosaiques constitués de zones issue de ces cellules modifiées et des cellules de l'embryon receveur.

Produire un lignage homozygote

On sélectionne parmi ces organismes des individus qui ont leurs cellules germinales modifiées et on les croise avec des souris habituelles.
On re-croise la descendance en sélectionnant celles qui ont reçu le gène modifié ( Knockout), jusqu'à obtenir des individus qui sont Homozygotes pour ce gène modifié.


Principe de production des souris Knockout. (Source)

Le mécanisme détaillé est fort bien présenté dans ce document on-line de Gilles Furelaud dont je me suis largement inspiré ainsi que d'un article du Temps du 9 octobre ou le Pr Antonarakis de l'Uni Genève commente cette technique est tout à fait intéressant (cf plus bas)

Et si le gène est nécessaire au développement ?
On a récemment pu mettre au point des méthodes de knockout conditionnel permettant d'inactiver un gène seulement à un moment ou dans un tissu donné.

A quoi ça sert ?

On a de cette manière produit des souris auxquelles un gène était inactivé pour comprendre l'effet de ce gène ou pour explore comment soigner une maladie (des souris avec le même gène CFTR inactivé qui cause la mucoviscidose ont pu être produites). Ces techniques sont utilisées pour d'innombrables recherches Les travaux du Pr. Duboule de l'uni Genève - très connu pour ses recherches sur les gènes architectes notamment les Hox - ont beaucoup fait appel à ce type de méthodes.
Il y a un exemple dans la page de Fureland montrant comment on peut utiliser cette technique pour voir où s'exprime le gène (Hox B8 en bleu) dans ce cas.

Exemples frappants et visuels de souris Knockout

Souris Fluorescentes
Souris transgénique pour la GFP (green fluorescent protein) : rend les souris fluorescentes lors d'une exposition aux rayons ultraviolets.

Souris Nude mice
Souris qui n'ont pas de cheveux (les follicules sont là mais défectueux) plus grave encore : pas de lymphocytes T (les lymphocytes précurseurs sont ok, mais le thymus est défectueux et la différenciatino en T ne se fait pas) . Le système immunitaire humoral est intact mais elles sont très susceptibles au cancer. Vous pourriez vous commander ces souris ici. d'où ces infos ont été tirées. Merci à P. Brawand de ces précisison

Les souris au gène de la myostatine Knockouté (on peut dire ça ?) que nous avons vu il y a peu dans ce blog.

Il y a des lignages de souris Knockoutées pour milliers de gènes différents.

Et les RNAi ?
Comme les RNAi ont le potentiel de désactiver un gène localement, je me demande si les RNAi vont remplacer certains usages. Complément d'info de M. Strubin : "Pas certain... Les siRNA permettent de "down-réguler" l'expression d'un gène donné. Mais souvent l'effet n'est que partiel; diminution de 5 à 10x."


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